Легков В.В., Сапунов В.Б.Резюме: Работа ставила две цели: 1 .Установление полиморфизма дикой популяции дрозофилы / Drosophila melanogaster/ по срокам эмбрионального развития в норме., 2. Исследование влияния ультразвуковой обработки на основные характеристики эмбрионального развития. Установлено, что у мух дикого типа в норме наблюдается 2 пика вылупления личинок из яиц. Первый имеет место после 8 часов от момента откладки яиц, второй — после 32 часов. Под влиянием обработки ультразвуком растет доля яиц, из которых не вылупились личинки. Есть зависимость этой доли от2. интенсивности ультразвука (в пределах от 0,05 до 1,0 Вт\см ). Зависимости от времени воздействия ультразвуком не прослеживается (во временных пределах от 5 до 30 минут). Обработка ультразвуком индуцирует дополнительный пик вылупления личинок из яиц, который наблюдается вскоре после воздействия. Во всех случаях обработка ультразвуком способствует расширению изменчивости по срокам вылупления личинок. Несмотря на обилие работ по изучению эмбриогенеза у насекомых (1, 2 и др.), многие параметры и характеристики его до сих пор не изучены. Это касается даже дрозофилы Drosophila melanogaster - очевидно, наиболее изученного вида во всем животном царстве. Период её эмбрионального развития оценен в 20 часов (3). При этом нам не известны данные об изменчивости этой величины в норме и под влиянием внешних агентов. Неизвестно, существует ли природный полиморфизм по срокам развития яиц у дрозофилы. Настоящая работа призвана начать заполнять этот пробел в биологии развития насекомых. Для более полного понимания закономерностей эмбриогенеза целесообразно проанализировать его не только в норме, но и под влиянием повреждающего агента. Такое влияние может вскрыть дополнительные стороны протекания эмбриогенеза. В качестве повреждающего агента был выбран ультразвук. Относительная изученность физиологии его действия ( 4 ) позволяет легче трактовать полученные результаты. Работы по изучению физиологического и генетического действия ультразвука особенно актуальны сейчас, когда ультразвук стал одним из весомых компонентов полевого загрязнения окружающей среды. Таким образом, целями работы являлись: 1 .Установление полиморфизма дикой популяции D. мelanogaster по срокам эмбрионального развития в норме. 2 .Исследование влияния ультразвуковой обработки на основные характеристики эмбрионального развития: сроки и долю невылупившихся яиц. Материалы и методика. Работа велась на дрозофилах вида Drosophila мelanogaster дикого типа линии Кантон-С. Мухи в количестве нескольких десятков тысяч помещались в популяционный ящик, в течении нескольких дней популяция стабилизировалась. Кормление осуществлялось стандартной полной изюмовой средой. Температуру поддерживали 25 1 °С при условиях естественного светового дня (опыты проводились в феврале на широте Санкт-Петербурга). В специально закрывающиеся отверстия на ящике помещали стандартные полиэтиленовые пробки диаметром 1 см, заполненные стандартной агаровой средой, смазанной дрожжами. В течении ЗО минут мухи откладывали на пробки яица, в результате чего получалась синхронная кладка. Пробки вынимали, часть оставляли в качестве контроля, часть “озвучивали” ультразвуком в дистиллированной воде (контрольные яйца также помещали в воду, но без озвучивания). Предусмотрены были следующие варианты обработки ультразвуком : длительность воздействия 5, 10, 15, 20, 25 и 30 минут, с точностью 0.5 минут; Интенсивность ультразвука 0,05; 0,2; 0,4; 0,7; 1,0 Вт\см2. В качестве излучающего прибора использовали медицинский терапевтический ультразвуковой генератор УЗТ-0,88-4-0 1-Ф с частотой 0,88 МГц и штатные излучатели. Обработку среды производили в непрерывном режиме в поле бегущей волны. Для обработки были выбраны две стадии онтогенеза, через 30 минут после конца откладки яиц и через 10 часов. Наблюдение за вылуплением личинок начинали сразу же после откладки и вели в течении 2-х суток. Каждый опыт проводился в трех повторностях. Объем выборки составил около 2 000 яиц, тысячу из которых составлял контроль. На каждую экспериментальную точку бралось не менее 20 яиц. Получившиеся кривые вылупления анализировали с помощью методов математической статистики (метод Стьюдента, Фишера, Хи-квадрат, наименьших квадратов и т.д.) Результаты и обсуждение. Анализ динамики вылупления личинок из яиц в контроледемонстрирует картину, изображенную на рис 1. Здесь и далееприведены кривые после статистической обработки (методы Хи-квадрат и наименьших квадратов). Первые единичные личинки вылупляются в течении 2-3 часов после откладки яиц. Очевидно, их развитие частично прошло в материнском организме. После 8-ми часов формируется первый пик вылупления. В это время рождается около 20% личинок. Координаты пика — среднее 8,17 часов, среднее квадратичное отклонение = 1,0. После этого вылупление замедляется, держится на стабильно низком уровне (менее одного процента яиц от объема выборки каждый час) несколько часов. Новый, несколько более размазанный, пик достигается после 32 часов. Его координаты: среднее 32,2 часа, среднее квадратичное отклонение 2,5. Доля совсем невылупившихся яиц невелика, составляет 2,9 +0.5 %, что соответствует литературным данным (1). Каждый из двух пиков удовлетворительно апроксимируется распределением Гаусса. Из полученных результатов следует, что приведенные в литературе данные о среднем сроке развития яиц в 20 часов (З ) нуждаются в уточнении. Речь идет о двух максимумах вылупления. Среднее значение условно, т.к. именно в это время вылупляется лишь незначительная часть личинок. Причин диморфизма может быть две. Первая - диморфизм самих эмбрионов по срокам развития. Вторая - физиология материнского организма, которая приводит к тому, что часть яиц выходит наружу быстро после образования, а часть задерживается в организме на некоторый срок, где и проходят первые этапы эмбрионального развития. Обратимся к рассмотрению данных опытов, предусматривающих обработку яиц ультразвуком. Данные по трем повторностям не выявляют достоверных различии, поэтому приводятся суммарно. Не выявлено также достоверного влияния времени воздействия (от 5 до 30 минут) ультразвуком интенсивностью от 0,05 до 1,0 Вт\см2 на анализируемые параметры развития. Очевидно, биологический эффект ультразвука формируется в первые несколько минут и дальнейшее воздействие его уже не модифицирует. Поэтому, данные опытов с разными сроками воздействия приведены суммарно. Первый и наиболее простой критерий биологического действия ультразвука - доля яиц, не вылупившихся в течении всего срока наблюдения (Табл.). В контроле она составляет около 3%, что соответствует и литературным данным ( 5 ). Сравнительно невысокий процент неразвившихся яиц говорит о том, что доля неосемененных самок, откладывающих неоплодотворенные яйца и насыщенность популяции доминантными летальными мутациями, вызывающими гибель эмбрионов, незначительны. Под влиянием ультразвуковой обработки доля невылупившихся яиц росла (Табл.). При обработке яиц на ранней стадии зависимость “доза (точнее, интенсивность) - эффект” не обнаружена. Корреляция между интенсивностью и выходом неразвившихся яиц достоверно неотличима от нуля. При обработке ультразвуком интенсивностью 1,0 Вт\см2 на поздней стадии эмбриогенеза наблюдается рост доли неразвившихся яиц. Другие использованные интенсивности дали подобный эффект. Специально в этой статье эти варианты не анализируются. Коэффициент корреляции между интенсивностью ультразвука (от 0,05 до 1,0 Вт\см2.) и процентом невылупившихся яиц составляет 0,6 +0.1 Кривые распределения сроков вылупления яиц во всех случаях обработки на ранней стадии не отличаются достоверно друг от друга и приведены суммарно (рис 2.). Результаты обработки на стадии 10 часов также примерно сходны в случае разных вариантов воздействий. В случае высоких интенсивностей, как отмечалось выше (Табл.), повышен выход невылупившихся яиц, но вид кривой остается тот же самый . При обработки яиц возраста 10 часов возникает интересный эффект - формирование нового пика через несколько часов после воздействия. Параметры пика - среднее время 15,1 часов, среднее квадратичное отклонение =1,5. Это значит, что на часть яиц ультразвук оказывает стимулирующее действие, ускоряя их биологическое время и течение эмбриогенеза. Другая часть яиц - до 53% просто погибает (Табл.). Принципиальный эффект ультразвука, по крайней мере интенсивностей от 0,05 до 1,0 Вт\см2, состоит в том, что во все случаях у особей увеличивается изменчивость по срокам выхода личинок из яиц. Показатели изменчивости (средние квадратичные отклонения) в результате обработки во всех случаях выше, чем в контроле (сравнение проведено методом Фишера). Таким образом, подтверждается положение, что стресс приводит кповышению фенотипической изменчивости популяции ( б). Обработка яиц ультразвуком с теми же параметрами, но на ранней стадии эмбриогенеза (рис 2.) привела к возникновению небольшого, но достоверного дополнительного ника вылупления в районе 40 часов (параметры приведены на рисунке). Этот пик можно трактовать, как увеличепие сроков развития под влиянием ультразвука у части эмбрионов. Таким образом, обработка ультразвуком интенсивностью от 0,05 до 1,0 Вт\см2 с временем воздействия от 5 и до 30 минут приводит к значительным изменениям параметров эмбрионального развития на популяционном уровне. Дальнейшие исследования эффектов действия физических агентов на эмбриогенез смогут вскрыть новые существенные стороны биологии развития насекомых. Полученные данные, на наш взгляд, важны в связи с проблемами экологии и охраны окружающей среды. В настоящее время создано и функционирует множество приборов и технических установок, узлучающих ультразвук, под действие которого попадают животные и пюди. Несмотря на видимое отсутствие явного повреждающего воздействия этих излучений, они могут вносить серьезный вклад в полевое загрязнение окружающей среды. Из представленных данных следует, что даже кратковременное воздействие ультразвуком в диапазоне от 0,05 до 1 ,0 Вт\см2 могут иметь мутагенное и тератогенное действие. Выводы. 1 .У мушек D. melanogaster дикого типа в норме наблюдаются два пика вылупления личинок из яиц. Первый имеет место после 8-ми часов от момента откладки яиц, второй после 32 часов. 2.Под влиянием обработки ультразвуком интенсивностью от 0,05 до 1,0 Вт\см2 растет доля яиц, из которых не вылупились личинки. З .Обработка ультразвуком с интенсивностью от 0,05 до 1 ,0 Вт\см2 индуцирует дополнительный пик вылупления лячинок, через 4 часа после возлействия. 4.Обработка ультразвуком с интенсивностью от 0,05 до 1,0 Вт\см2 способствует расширению изменчивости по срокам вылупления. Авторы благодарят Л.3.Кайданова и О.В.Кузнецову за помощь в проведении экспериментов. |
|
© 1997—2012 Российский государственный гидрометеорологический университет Сайт разработан в СЦНИТ «ИнфоГидромет» |